bg

Burkholderia glumae, Bakteri Penyebab Hawar Pada Malai Padi

oleh Lilis Suryani, SP. MP.01 November 2017

berita-news-karantina-pertanian
qr-code

Burkholderia glumae Kurita et Tabei ialah bakteri penyebab hawar malai padi. Penyakit ini menyebabkan bulir membusuk dan berubah warna atau bibit membusuk. Penyakit ini menjadi masalah serius pada budidaya padi di Amerika Serikat, Jepang dan Korea (Devescovi et al., 2007). Di Jepang, penyakit ini mulai menjadi masalah serius pada produksi padi sejak 1955 (Jeong et al., 2003). Berdasarkan Peraturan Menteri Pertanian Nomor 51/Permentan/KR.010/9/2015 tentang Jenis Organisme Pengganggu Tumbuhan Karantina, B. glumae termasuk OPTK A2, dengan daerah sebar pulau Jawa, Sumatera, dan Kalimantan. Bakteri B. glumae termasuk bakteri tular benih. Benih padi pada umumnya diproduksi oleh produsen benih di pulau Jawa. Potensi penularan penyakit melalui benih sangat besar. Apabila bakteri menyebar ke seluruh Indonesia melalui perdagangan benih maka penyakit ini menjadi sangat penting dan berbahaya. Namun demikian, penelitian tentang bakteri B. glumae di Indonesia masih sedikit, karena itulah informasi tentang penyakit hawar malai padi yang disebabkan oleh B. glumae perlu dikaji lebih dalam.

Gejala penyakit hawar malai padi terdapat pada malai dan bibit. Malai yang terserang akan berubah warna. Kulit sekam padi berwarna coklat atau membusuk dan spikelet menjadi steril pada kondisi malam yang hangat dengan kelembaban tinggi. Sedangkan bibit mengalami hawar atau membusuk. Secara umum gejala penyakit ini disebut hawar malai (panicle blight). Gejala penyakit muncul pada saat tanaman memasuki fase berbunga (Jeong et al., 2003; Devescovi et al., 2007; Nandakumar et al, 2009). Gejala awalnya ialah perubahan warna atau menjadi kuning pucat pada kulit sekam yang membesar dengan cepat keseluruh kulit sekam, kemudian warna berubah putih abu-abu, kuning kecoklatan atau coklat kemerahan. Penyakit menyebabkan kehilangan hasil yang besar karena bulir menjadi steril atau tidak masak sempurna (Wakimoto et al., 1987).

Penyakit hawar malai ditularkan melalui benih. Bakteri B. glumae menyerang bulir pada saat masih di pertanaman dan terbawa hingga panen. Bakteri dapat bertahan selama tiga tahun di dalam benih padi. Patogen tidak hanya ditemukan pada benih padi yang bergejala sakit namun juga pada benih padi yang tampak sehat atau tanpa gejala. Pada tahun 2007 penelitian Luo et al. pertama kali melaporkan ditemukannya B. glumae pada benih padi tanpa gejala (tampak sehat) di Cina. Sejumlah studi menunjukkan bahwa,pada tanaman padi, pergerakan B. glumae menuju ke bagian pelepah yang lebih atas tergantung pada kerapatan populasi bakteri. Kerapatan B. glumae yang tinggi memacu infeksi ke bagian spikelet. Bakteri tumbuh dengan cepat di dalam spikelet setelah pembungaan dan bakteri pembusuk biji berkembang. Secara umum bakteri tidak tumbuh dengan cepat dan saprofit pada padi, kecuali di dalam spikelet selama 10 hari setelah pembungaan (Hikichi et al., 1998). Infeksi pada malai/biji inilah yang menyebabkan bakteri terbawa di dalam benih.

Taksonomi bakteri Burkholderia glumae berkembang dan berubah seiring dengan kemajuan teknologi. Bakteri ini termasuk dalam kingdom Prokaryota, divisi Gracilicutes, kelas Proteobacteria, famili Pseumonadaceae, genus Burkholderia. Bakteri ini sebelumnya dinamakan Pseudomonas glumae. Awalnya, Paleroni et al. pada tahun 1973 mengajukan pembagian genus pseudomonas menjadi lima kelompok homologi rRNA berdasarkan persentase kemiripan berbagai spesies. Selanjutnya pada tahun 1992 oleh Yabuchi et al. mengajukan agar spesies Pseudomonas patogenik dari grup RNA II diklasifikasi ulang kedalam genus baru yaiyu Burkholderia berdasarkan data taksonomi polyphasic. Genus ini terdiri dari 7 spesies ialah B. cepacia, B. gladioli, P. plantarii, B. caryophylli, P. glumae, B. solanacearum, B. pickettii. Pada tahun 1994, Urakami et al., mengajukan perubahan nama Pseudomonas glumae menjadi Burkholderia glumae. Penelitian Maeda et al. (2006) menjelaskan bahwa bakteri B. glumae mempunyai hubungan filogeniti yang erat dengan B. gladioli dan B. plantarii yang juga menyerang padi.

Burkholderia glumae mempunyai karakter morfologi yang khas. Koloni bakteri akan tumbuh dengan bentuk yang khas bila ditumbuhkan dalam medium spesifik yaitu medium S-PG. Koloni bakteri berbentuk bulat, cembung, seluruh koloni berwarna coklat kemerahan (tipe A), atau opalescent (seperti susu) dengan tengah berwarna ungu atau ungu kemerahan (tipe B). Burkholderia spp. lainnya dan pseudomonads dapat tumbuh di media tersebut namun dengan morfologi koloni yang berbeda (Schaad et al., 2001). Pertumbuhan B. glumae pada media selektif lainnya yaitu media CCNT, bakteri akan membentuk koloni berwarna putih kekuningan dengan pigmen kuning yang terlarut dalam media sehingga mudah dibedakan dengan bakteri lainnya setelah diinkubasikan pada suhu 41⁰C selama 2-4 hari (Kawaradani et al., 2000).

Bakteri B. glumae memiliki karakter biokimia yang membedakan dengan bakteri lainnya. Schaad et al. (2001) menjelaskan bakteri bersifat gram negatif, berbentuk lurus atau melengkung (0,5-1 µm dan 1,5-4 µm), flagel polar atau multitrichous, katalase positif dan mengakumulasi poly-β-hydroxybutyrate (PHB). Bakteri B. glumae dapat tumbuh pada suhu 40⁰C dan pada 4% NaCl, arginine dihydrolase positif, hidrolisis gel positif, hidrolisis pati negatif, hidrolisis pectate negatif. Karakter bakteri berdasarkan penggunaan sumber karbon ialah β-alanine, arginine, betaine, L-valine, adonitol, levulinate, N-propanol, D-sorbitol, trehalose, D-xylose positif. Sedangkan penggunaan sumber karbon dari benzoate, lactose, L-rhamnose, sucrose, D-tartrate negatif.

Virulensi B. glumae dipengaruhi oleh phytotoxin.toxoflavin. Toksin ini berperan pada perkembangan luka pada tanaman padi. Phytotoxin.toxoflavin {1,6-dimethylpyrimido[5,4-E]-1,2,4-triazine-5,7(1H,6H)-dione}, ialah pigmen kuning yang esensial untuk patogenesitas. Toxoflavin yang diproduksi B. glumae mengurangi pertumbuhan akar dan daun pada bibit dan memacu gejala klorotik pada malai padi (Suzuki et al., 1998; Kim et al., 2004; Suzuki et al,, 2004). Produksi toxoflavin dalam B. glumae dan transportasinya di dalam sel tanaman diatur oleh quorum sensing melalui N-acyyl homoserine lactone (Kim et al., 2004; Maeda et al., 2007).

Penghambatan mekanisme quorum sensing dapat dianggap sebagai suatu peluang untuk mengatur perkembangan penyakit. Akhir-akhir ini diketahui bahwa Bacillus spp. dan bakteri gram negatif lainnya mempunyai mekanisme seperti quorum sensing yang dinamakan quorum quenching, yang secara langsung mendegradasi molekul sinyal quorum sensing (Dong et al., 2000; Lee et al., 2002). Penelitian Cho et al. (2006) menggunakan Burkholderia sp. strain KJ006 yang bersifat non patogenik dan endofit pada tanaman padi untuk mengganggu quorum sensing B. glumae. Bakteri Burkholderia sp. strain KJ006 dimodifikasi dengan mengintroduksikan gen pengkode enzim penghancur AHL (AHL lactonase aiiA) dari Bacillus thuringiensis. Strain KJ006 baru yang telah dimodifikasi (pKEA-aiiA) dengan sukses melemahkan perkembangan gejala yang umum disebabkan oleh B. glumae.

Pengendalian penyakit dilakukan dengan bahan kimia seperti tembaga, antibiotik kasugamycin, probenazole dan pyroquilon. Perlakuan benih dan aplikasi oxolinic acid (OA) pada stadia keluarnya malai dari batang (heading stage) mempunyai efikasi yang tinggi terhadap pengendalian busuk biji dan bibit. Bahan kimia menghambat pertumbuhan bakteri pada plumula dan spikelet. Sistem pengendalian dimana perlakuan benih dan aplikasi OA pada malai dikombinasikan dengan seleksi benih dengan larutan garam, mempunyai efikasi yang tinggi dan sangat berdampak pada siklus infeksi B. glumae (Hikichi et al., 1998).

Deteksi bakteri patogen terbawa benih dapat dilakukan dengan berbagai metode, antara lain dengan media selektif, uji biokimia, uji biologi, uji ELISa atau PCR. Deteksi B. glumae pada benih padi dapat dilakukan dengan salah satu atau seluruh metode tersebut. Benih padi yang beredar di pasar atau di tingkat petani berpotensi membawa bakteri B. glumae pada kondisi benih menunjukkan gejala atau tanpa gejala. B. glumae pada benih padi berperan sebagai propagul awal yang dapat berkembang menjadi epidemi apabila kondisi lingkungan mendukung. Langkah-langkah untuk melakukan isolasi bakteri B. glumae dari benih padi dapat dilakukan dengan metode pencucian benih (Anonymous, 2008), ialah: Benih sampel yang akan diuji ditimbang, cuci benih dengan aquades steril. Sterilisasi permukaan benih dengan merendam benih dalam 10% klorox selama 2 menit., bilas dengan aquadest steril sebanyak dua kali. Benih tersebut dimasukkan ke dalam tabung Erlermeyer yang berisi aquades steril sebanyak 10 kali berat biji. Tabung erlermeyer yang berisi benih diinkubasi sambil digoyang menggunakan penggoyang (shaker) pada kecepatan 200 rpm selama 16-18 jam pada suhu ruang (21⁰C). Suspensi bakteri yang terbentuk dibuat seri pengenceran 10-1, 10-2, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 dan 10-8. Dari setiap seri pengenceran diambil 100 µl suspensi dan disebarkan pada medium isolasi dalam cawan petri menggunakan drigalski. Cawan petri diinkubasikan pada suhu ruang selama 24-48 jam jika dibiakkan pada media SPG, atau jika menggunakan media CCNT maka diinkubasikan selama 2-4 hari pada 41oC. Koloni bakteri yang tumbuh dipindahkan ke media yang baru sehingga diperoleh biakan murni. Setelah diperoleh biakan murni bakteri B. glumae, maka selanjutnya dapat dilakukan identifikasi dengan melakukan uji biokimia. Schaad et al.(2001) menjelaskan karakteristik yang digunakan dalam identifikasi Burkholderia. Setelah dilakukan uji biokimia maka dilakukan uji hipersensitif.

Deteksi bakteri B. glumae dapat dilakukan antara lain dengan media selektif. Pada tahun 1986 Taushima et al. menemukan media selektif SPG untuk menumbuhkan B. glumae. Medium tersebut terdiri atas KH2PO4 (1,3 g), Na2HPO4 (1,2 g), (NH4)sSO4 (5 g), MgSO4.7H2O (0,25 g), Na2MoO4.7HO (24 mg), EDTA-Fe (10 mg), D-sorbitol (10 g), Methyl violet (1 mg), Phenol red (20 mg), Agar (15 g). Setelah diautoclave, tambahkan 1 ml dari larutan stok steril yang telah disaring sebagai berikut : L-cystine (1mg/100 ml stock), Pheneticillin, potassium salt (5 g/100 ml stok), Ampicillin, sodium salt (1 g/100 ml stok), Cetrimide (1 g/100ml stock). Koloni bakteri B. glumae pada media berbentuk bulat, cembung, seluruh koloni berwarna coklat kemerahan (tipe A), atau opalescent (seperti susu) dengan tengah berwarna ungu atau ungu kemerahan (tipe B).

Pada tahun 2000, Kawaradani et al. menemukan media selektif baru CCNT dengan komposisi yang lebih sederhana dan lebih tinggi selektifitasnya dibandingkan media SPG. Koloni bakteri berwarna putih kekuningan setelah diinkubasi pada media CCNT selama 2-4 hari pada suhu 41oC dengan pigmen kuning larut dalam media. Komposisi media CCNT untuk 1 liter ialah: Yeast ekstrak (2 g), Polypepton (1 g), Inositol (4 g), Cetrimide (10 mg), Chloramphenicol (10 mg), Novoblocin (1 mg), Chlorotaronil (100 mg), Agar (18 mg), Aquades (1000 ml). Setelah diperoleh biakan murni bakteri B. glumae, maka selanjutnya dapat dilakukan identifikasi dengan melakukan uji biokimia.

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler (mesin PCR). Dalam proses PCR diperlukan sepasang primer yang akan mengapit posisi DNA target yang kita gandakan. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida. Primer forward ialah primer yang berada sebelum daerah target sedangkan primer reverse ialah primer yang berada setelah daerah target (Anonymous, 2008). Penelitian Takeuchi et al. (1997) menemukan sepasang primer yang spesifik untuk deteksi B. glumae yaitu GL-13f (5’-ACACGG-AACACCTGGGTA-3’) dan GL-14r (5’-TCGCTCTCC-CGAAGAGAT-3’). Primer ini juga digunakan oleh Luo et al. (2007) untuk menguji bakteri yang diisolasi dari benih tanpa gejala, dan hasilnya bakteri tersebut positif B. glumae.

PCR untuk deteksi B. glumae pada benih padi dapat dilakukan dengan mengadaptasi metode yang dilakukan oleh Takaeuchi et al. (2007). Ekstrasi DNA tidak dilakukan langsung dari benih padi, karena benih umumnya mengandung inhibitor polymerase, sehingga benih ditumbuhkan lebih dahulu dengan metode perkecambahan (growing on test) agar inhibitor berkurang sehingga DNA mudah diisolasi dan perkecambahan dapat meningkatkan konsentrasi bakteri. Bibit padi yang telah dikecambahkan selam 14 hari dipotong kecil-kecil, kemudian ditimbang sebanyak 10-20 mg dan dihancurkan di dalam mortar dengan ditambahkan 1 ml larutan NaCl 0,85%. Suspensi dimasukkan ke dalam micro tube dan disentrifuge pada 10.000 rpm selama 5 menit. Pelet diresuspensikan dalam 0,1 ml akuades steril, simpan pada suhu 95oC selama 8 menit, kemudian disentrifuse pada 10.000 rpm selama 5 menit. Sebanyak 5 ml supernatan digunakan secara langsung sebagai cetakan (template) untuk PCR.